تعمیر الکتروفورز آزمایشگاهی

 

الکتروفورز یک تکنیک بسیار پرکاربرد است که اساساً جریان الکتریکی را روی مولکول های بیولوژیکی اعمال می کند و این قطعات را به قطعات بزرگتر یا کوچکتر جدا می کند. این تکنیک کاربردهای مختلفی دارد. الکتروفورز یک فرآیند الکتروکینتیک است که ذرات باردار را در یک مایع با استفاده از یک میدان بار الکتریکی جدا می کند. این ماده اغلب در علوم زندگی برای جداسازی مولکولهای پروتئین یا DNA مورد استفاده قرار می گیرد و بسته به نوع و اندازه مولکول ها از طریق چندین روش مختلف به دست می آید. این روش ها از جهاتی متفاوت است اما همه آنها به یک منبع برای بار الکتریکی، یک محیط پشتیبانی و یک محلول بافر نیاز دارند. الکتروفورز در آزمایشگاه ها برای جداسازی مولکول ها بر اساس اندازه، چگالی و خلوص استفاده می شود. از الکتروفورز ژل می توان برای اهداف مختلفی استفاده کرد، به عنوان مثال:

برای گرفتن اثر انگشت DNA برای اهداف پزشکی قانونی وآزمایش های وراثتی. برای اینکه بتوانید اثر انگشت DNA  بگیرید تا بتوانید به دنبال روابط تکاملی موجودات باشید. برای بررسی واکنش PCR، برای آزمایش ژن های مرتبط با یک بیماری خاص.

کاربرد های الکتروفورز

در پزشکی قانونی برای تعیین هویت افرادی که ممکن است در یک جرم دست داشته باشند (از طریق پیوند دادن الگوی DNA آنها با پایگاه های اطلاعاتی )، در تحقیقات روی پروتئین ها و تحقیقات روی جهش های ژنتیکی که بسیار مهم هستند. وقتی پروتئین ها یا DNA جهش می یابند، اغلب طولانی تر یا کوتاهتر هستند، بنابراین در ژل الکتروفورز متفاوت از حد طبیعی ظاهر می شوند، بنابراین بسیاری از آزمایش های تشخیصی هنوز با استفاده از الکتروفورز انجام می شود، بنابراین تکنیک الکتروفورز یک روش تحقیق اساسی بسیار گسترده، برای درک عملکرد ژن و پروتئین است.

الکتروفورز معمولاً در جعبه ای (تانک الکتروفورز) انجام می شود که در انتهای آن بار مثبت و در انتهای دیگر بار منفی دارد. همانطور که همه ما در فیزیک پایه آموخته ایم، هنگامی که شما یک مولکول باردار را در محیطی مانند آن قرار می دهید، مولکول های منفی به سمت بار مثبت می روند و بالعکس.

در موردDNA ، DNA یک مولکول بسیار طولانی است، بنابراین شما نمی خواهید در بیشتر موارد، یک مولکول DNA کامل از یک سلول روی ژل اجرا کنید. زیرا DNA آنقدر بزرگ است که هرگز به ژل وارد نمی شود، بنابراین آنچه دانشمندان انجام می دهند و آنچه که مردم این روزها در کلاس های درس انجام می دهند، خرد کردن آن DNA با استفاده از مواردی مانند آنزیم ها است که DNA را به قطعات قابل کنترل تر خرد می کند.  سپس این قطعات، بسته به اندازه قطعات، کم و بیش داخل ژل از بالا به پایین مهاجرت می کنند.

الکتروفورز به عنوان مهاجرت یون های باردار در یک میدان الکتریکی تعریف می شود. در هادی های فلزی، جریان الکتریکی با حرکت الکترون ها، عمدتا در امتداد سطح فلز، حمل می شود. در محلول ها، جریان الکتریکی بین الکترودها جریان دارد و توسط یون ها حمل می شود. یون هایی که به سمت آند مهاجرت می کنند، به دلیل مهاجرت آندی، “آنیون” نامیده می شوند. یونهایی که به کاتد مهاجرت می کنند “کاتیون” نامیده می شوند.

اصول الکتروفورز

وقتی مولکول های باردار در یک میدان الکتریکی قرار می گیرند، آن ها با توجه به بار خود به سمت قطب مثبت یا منفی مهاجرت می کنند. بر خلاف پروتئین ها، که می توانند بار مثبت یا خالص منفی داشته باشند، اسیدهای نوکلئیک دارای بار منفی ثابت هستند که توسط فسفات آنها پخش می شود و به سمت آند مهاجرت می کنند.

یونی که در چنین میدان الکتریکی قرار گرفته باشد، نیرویی را تجربه خواهد کرد:

جایی که،

F =نیروی الکتروفورتیک

K = یک ثابت

q  = بار خالص پروتئین (بارهای اتمی / مولکول پروتئین)

 

عوامل موثر در الکتروفورز:

حرکت پروتئین ها به جنبه های مختلف بستگی دارد. در داخل ژل، مولکول ها باید از داخل قطب به قطب دیگر منتقل شوند. مولکول های کوچکتر در مقایسه با مولکول های بزرگتر می توانند با سهولت بیشتری درون و خارج ماتریس ژل ببافند. به عنوان یک قاعده کلی، مولکول ها اگر بار خالص بیشتری داشته باشند و قطر کوتاه تر داشته باشند، سریع حرکت می کنند.

pH بافر

این امر بر جهت و سرعت انتقال پروتئین تأثیر خواهد گذاشت.حرکت پروتئین ها به جنبه های مختلف بستگی دارد. یکی از آنها بارهای پروتئین ها است. پروتئین ها توالی آمینو اسیدهایی هستند که می توانند یونیزه شوند و به اسید یا ویژگی اصلی آنها بستگی دارد. بار الکتریکی خالص پروتئین مجموع بارهای الکتریکی موجود در سطح مولکول به عنوان تابعی از محیط است.

سرعت مهاجرت به قدرت بارهای سطح خالص آنها بستگی دارد. بسته به pH بافر، پروتئین های موجود در یک نمونه بارهای مختلفی را حمل می کنند. در pI (نقطه ایزوالکتریک) یک پروتئین خاص، مولکول پروتئین هیچ بار خالصی را حمل نمی کند و در یک میدان الکتریکی مهاجرت نمی کند. در pH بالاتر از pI ، پروتئین دارای بار منفی خالص است و به سمت آند مهاجرت می کند. در pH زیر pI پروتئین یک بار مثبت خالص بر روی سطح خود به دست می آورد و به سمت کاتد مهاجرت می کند.

قدرت یونی بافر

قدرت یونی بافر، نسبت جریان منتقل شده توسط پروتئین ها را تحت تأثیر قرار می دهد.در قدرت یونی کم پروتئین ها نسبتاً جریان زیادی را حمل می کنند و بنابراین نسبتاً سریع مهاجرت خواهند کرد. در قدرت یونی بالا، بیشتر جریان توسط یون های بافر منتقل می شود و بنابراین پروتئین ها نسبتاً آهسته مهاجرت می کنند. تشبیه ممکن است در تجسم این اثر قدرت یونی مفید باشد.

بنابراین، در الکتروفورز، قدرت یونی کم ترجیح داده می شود زیرا سرعت مهاجرت پروتئین ها را افزایش می دهد. مقاومت یونی کم نیز ترجیح داده می شود زیرا تولید گرمای کمتری می کند. با فرض ولتاژ ثابت، اگر قدرت یونی افزایش یابد، مقاومت الکتریکی کاهش می یابد اما جریان افزایش می یابد. بنابراین یک بافر با قدرت یونی بالا منجر به تولید گرمای بیشتر می شود و بنابراین یک قدرت یونی کم ترجیح داده می شود.

شیب ولتاژ

سرعت انتقال به شیب ولتاژ بستگی دارد: گرادیان ولتاژ بیشتری در میدان الکتریکی وجود دارد، پروتئین با سرعت بیشتری به سمت آند (یا کاتد) حرکت می کند.

الکترواسموز

حرکت نسبی مایع بر روی محیط جامد در یک میدان الکتریکی، الکترواسموز نامیده می شود. در میدان الکتریکی اعمال شده، الکترواسمزی جریان نمونه را تحریف کرده و جدایی را محدود می کند.

به طور کلی اجزا و دستگاه های لازم برای فرایند الکتروفورز، شامل یک محفظه شیشه ای( تانک الکتروفورز) که بافر درون آن نگهداری می شود، شیشه های الکتروفورز (برای SDS PAGE، فضاساز ها(spacer))، ژل آگارز و پلی اکریل آمید، بافر ها، شانه الکتروفورز و یک منبع جریان الکتریکی است.

انواع الکتروفورز

انواع مختلفی از ژل ها معمولاً به عنوان محیط پشتیبانی الکتروفورز استفاده می شوند و بسته به اینکه کدام یک مفیدتر باشد به نوع استفاده از این تکنیک مرتبط است. صفحات ژل امکان اجرای همزمان بسیاری از نمونه ها را فراهم می کند و به همین دلیل اغلب در آزمایشگاه ها مورد استفاده قرار می گیرند.

ژل آگارز

معمولاً برای الکتروفورز DNA استفاده می شود. این ژل یک ساختار با منافذ بزرگ است که به مولکول های بزرگتر اجازه می دهد تا به راحتی حرکت کنند اما برای توالی مولکول های کوچکتر مناسب نیست. حلول مولکول های DNA در ژل قرار می گیرد. از آنجا که هر مولکول DNA بار منفی دارد، می تواند توسط یک میدان الکتریکی از طریق ژل کشیده شود. مولکول های کوچک DNA با سرعت بیشتری نسبت به مولکول های بزرگتر DNA از طریق ژل حرکت می کنند.

نتیجه یک سری “باند” است که هر باند حاوی مولکولهای DNA در اندازه خاصی است. نوارهای دورترین فاصله از ابتدای ژل حاوی کوچکترین قطعات DNA هستند. نوارهای نزدیک به آغاز ژل حاوی بزرگترین قطعات DNA هستند.

الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید (PAGE)

وضوح بیش تری نسبت به ژل آگارز دارد و آن را برای تجزیه و تحلیل کمی مناسب تر می کند. این امر امکان شناسایی چگونگی اتصال پروتئین به DNA را فراهم می کند. همچنین می تواند برای درک چگونگی مقاومت باکتری ها به آنتی بیوتیک ها از طریق تجزیه و تحلیل پلاسمیدها، مورد استفاده قرار گیرد. با استفاده از این تکنیک می توان  ۱۰۰ جفت باز (bp) DNA یا کمتر را جدا کرد. این روش مورد استفاده برای مطالعه پروتئین های فردی در سرم، به ویژه انواع ژنتیکی و ایزوآنزیم ها است.

الکتروفورز دو بعدی

مولکول ها را در امتداد یک محور X و یک محور Y جدا می کند. مولکول ها یک بار بر اساس بار و بار دیگر بر اساس اندازه جدا می شوند. به عبارتی اساس این روش، جدا کردن نمونه با دو روش جداسازی مجزا یا دو جداسازی الکتروفورز متفاوت است. بیشتر کاربردهای این تکنیک در زمینه های تحقیقاتی است. برای مطالعه خانواده پروتئین ها در زمینه پروتئومیکس و محتوای پروتئین در انواع مختلف سلول ها استفاده می شود. در ژنتیک برای بررسی تفاوت در بیماری ها، جهش های ژنی و DNA باکتری استفاده می شود. برای مطالعه سلولهای توموری برای تشخیص بدخیمی استفاده می شود.

Routine (Zone)

الکتروفورز آزمایشگاه بالینی سنتی که روی ژل مستطیل شکل انجام می شود. برای جداسازی پروتئین ها، جداسازی اسیدهای نوکلئیک استفاده می شود.

(High Resolution (HRE

الکتروفورز روتین با استفاده از ولتاژ بالا. از این تکنیک در شرایطی که نیاز به وضوح بیشتری از پروتئین ها باشد، به عنوان مثال، جداسازی پروتئین های CSF برای تشخیص بیماری مولتیپل اسکلروزیس و زنجیره های سبک در ادرار برای تشخیص زودهنگام اختلالات لنفاوی-پرولیفراتیو مانند میلوم چندگانه استفاده می شود.

Capillary (CE)

ترکیب الکتروفورز و کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا. CE در یک لوله مویرگی سیلیس بسیار نازک و ذوب شده با ژل پلی آکریل آمید یا آگارز صورت می گیرد. معمولاً در آزمایشگاه بالینی استفاده می شود. بسیار سریع ، کارآمد است. این تکنیک با استفاده از پردازش کامپیوتری و با حجم کم نمونه انجام می شود.

Isoelectric Focusing (IEF)

این ژل با مواد شیمیایی تزریق می شود که باعث ایجاد یک گرادیان PH در سطح ژل (آمفولیت) می شود. پروتئین ها با استفاده از ولتاژ بسیار بالا به نقطه ای از ژل مهاجرت می کنند که هیچ بار خالصی ندارند، یعنی همان نقطه ایزوالکتریک خود. در جداسازی هموگلوبین های مختلف در غربالگری قبل از تولد و ایزوآنزیم ها. تشخیص باندهای الیگوکلونال در گاما – گلوبولین از این روش الکتروفورز استفاده می شود.

Immunofixation

الکتروفورز ژل آگارز پروتئین های نمونه سرم را جدا می کند. آنتی سرم در برابر پروتئین مورد نظر مستقیماً روی ژل پخش می شود. پروتئین مورد علاقه در ماتریس ژل رسوب می کند. پس از یک مرحله شستشو برای حذف پروتئین های دیگر، پروتئین رسوب شده رنگ آمیزی می شود. آنتی ژن های پروتئینی و محصولات اسپلیت آنها مطالعه می شود. به عنوان مثال در تشخیص پروتئین های موجود در مولتیپل میلوما از این روش استفاده می شود.

Pulsed Field

جداسازی قطعه با اعمال متناوب نیرو در جفتهای مختلف الکترود حاصل می شود. متداول ترین روش، الکترودهای مثبت و منفی را در چرخه های حین الکتروفورز جایگزین می کند. قطعات بزرگتر DNA (> 50 کیلوباز) را که نمی توان با AGE یا PAGE در سیستم های الکتروفورز معمول جدا کرد، جدا می کند.

 

سبد خرید
شروع به تایپ کردن برای دیدن پستهایی که دنبال آن هستید.